DNA pull down實(shí)驗(yàn)技術(shù)

DNA pull down實(shí)驗(yàn)技術(shù)

1. 實(shí)驗(yàn)原理

DNA pull down是體外研究DNA與蛋白互作的有力工具。該技術(shù)將生物素標(biāo)記的DNA 片段結(jié)合在鏈霉親和素磁珠上，再與細(xì)胞核蛋白孵育，純化出與DNA 片段互作的蛋白，洗滌洗脫得到的蛋白產(chǎn)物，做Western blot檢測(cè)特定蛋白是否與靶DNA 片段結(jié)合；做質(zhì)譜鑒定即可篩選出與DNA 片段可能互作的蛋白信息(如：轉(zhuǎn)錄因子、組蛋白等)。

生物素與鏈霉親和素間的作用是目前已知強(qiáng)度最高的非共價(jià)作用；其中活化生物素可以在蛋白質(zhì)交聯(lián)劑的介導(dǎo)下，與已知的幾乎所有生物大分子偶聯(lián)。因此用生物素標(biāo)記核酸后，可以純化出與該核酸結(jié)合的各種生物大分子復(fù)合物。

2. 實(shí)驗(yàn)流程

1）探針設(shè)計(jì)及標(biāo)記：針對(duì)靶標(biāo)區(qū)域設(shè)計(jì)特異性DNA探針，探針經(jīng)過脫硫生物素標(biāo)記，跟偶聯(lián)在磁珠上的鏈霉親和素結(jié)合;

2）Pull down：細(xì)胞核提取物與磁珠-DNA探針孵育，靶DNA可以和DNA探針特異性結(jié)合，純化出與靶DNA 片段結(jié)合的蛋白復(fù)合體，經(jīng)過洗滌可以將非特異性結(jié)合蛋白質(zhì)去除；最后，洗脫得到與靶DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)復(fù)合物；

3）互作蛋白質(zhì)鑒定：再經(jīng)過Western Blot或質(zhì)譜(MS)鑒定蛋白質(zhì)。

3. 技術(shù)服務(wù)

1）DNA探針的設(shè)計(jì)與合成；

2）細(xì)胞培養(yǎng)與核蛋白提取；

3）Pull down捕獲互作蛋白；

4）Western blot驗(yàn)證；

4）MS鑒定可能的互作蛋白。

4. 交付結(jié)果

1）客觀公正的實(shí)驗(yàn)原始數(shù)據(jù)和分析結(jié)果；

2）提供詳細(xì)、完整的實(shí)驗(yàn)報(bào)告。

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