基于葡聚糖硫酸鹽納米光敏劑靶向腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的光動力抗癌療法

腫瘤中存在的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAMs）的M2樣表型促進(jìn)腫瘤生長和轉(zhuǎn)移。因此，靶向M2樣TAM是一種潛在的癌癥治療策略。然而，針對M2巨噬細(xì)胞的全身治療可能會抑制腫瘤組織中的TAM以及在正常過程中起關(guān)鍵作用的其他M2巨噬細(xì)胞，導(dǎo)致免疫功能低下狀態(tài)的風(fēng)險(xiǎn)增加。光動力療法（PDT）是一種非侵入性的局部癌癥治療方法，通過聯(lián)合使用光敏劑和無害光產(chǎn)生活性氧（ROS），誘導(dǎo)膜損傷和細(xì)胞凋亡。重要的是，PDT的治療效果僅限于光治療的腫瘤區(qū)域。因此，在不影響正常巨噬細(xì)胞的情況下，局部PDT是一種很好的癌癥治療選擇。本文作者Kyeongsoon Park將二者進(jìn)行結(jié)合，在International Journal of Biological Macromolecules（IF=8.5，一區(qū)）上發(fā)表題名為Tumor-associated macrophage-targeted photodynamic cancer therapy using a dextran sulfate-based nano-photosensitizer的研究成果，制備了一種基于葡聚糖硫酸鹽的納米光敏劑（葡聚糖硫酸鹽二氫卟吩e6, DS-Ce6），專門針對M2樣TAM進(jìn)行增強(qiáng)光動力治療（PDT），從而用于抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。

DS-Ce6是由DS（SR-A的特異性配體）與Ce6（光敏劑）化學(xué)偶聯(lián)合成的，作者通過UV/Vis和FT-IR分析證實(shí)了DS-Ce6的合成，并使用粒徑分析測量了DS-Ce6的粒徑大小和分布，最后進(jìn)行了單線態(tài)氧1O2的生成測試，在670 nm連續(xù)波激光照射下，使用單線態(tài)氧傳感器檢測DS-Ce6產(chǎn)生的單線態(tài)氧的量，以評估光動力療法的效果。通過這些合成和表征步驟，作者能夠確保DS-Ce6具有預(yù)期的化學(xué)結(jié)構(gòu)、粒徑和光敏性，使其能夠有效地被M2型TAMs攝取并在光照下產(chǎn)生細(xì)胞毒性的活性氧（ROS），從而實(shí)現(xiàn)對腫瘤細(xì)胞的有效殺傷。隨后作者驗(yàn)證了M2巨噬細(xì)胞SR-A的表達(dá)情況，在巨噬細(xì)胞的極化狀態(tài)中，M2巨噬細(xì)胞通常由IL-4和IL-13誘導(dǎo)，通過表達(dá)MRs （CD206）和SRs （SR-A, CD204）來識別。Western blot分析結(jié)果表明，IL -4衍生的M2巨噬細(xì)胞劑量依賴性地增加SR-A的表達(dá)。

作者在本實(shí)驗(yàn)研究了DS-Ce6對IL -4處理的巨噬細(xì)胞和共培養(yǎng)的4T1/巨噬細(xì)胞的體外細(xì)胞毒性。結(jié)果表明，在所有測試組中，IL -4處理的巨噬細(xì)胞的細(xì)胞存活率> 95%。經(jīng)DS-Ce6或未經(jīng)激光處理的Ce6共培養(yǎng)細(xì)胞毒性可忽略不計(jì)，這意味著未經(jīng)激光處理的DS-Ce6不發(fā)揮細(xì)胞毒性作用。而后作者在共培養(yǎng)的4T1/巨噬細(xì)胞中檢測了IL-4處理的巨噬細(xì)胞對游離Ce6和DS-Ce6的細(xì)胞內(nèi)攝取以及DS-Ce6與巨噬細(xì)胞的特異性結(jié)合。在IL-4處理的巨噬細(xì)胞中，DS-Ce6的細(xì)胞攝取高于游離Ce6；此外，在IL-4處理的巨噬細(xì)胞中，DS-Ce6的內(nèi)化比正常巨噬細(xì)胞強(qiáng)得多。數(shù)據(jù)表明，IL-4誘導(dǎo)的M2巨噬細(xì)胞上調(diào)SR-A的表達(dá)，且DS-Ce6進(jìn)入M2巨噬細(xì)胞是通過特異性結(jié)合SR-A介導(dǎo)的。

作者通過生物發(fā)光成像來評估DS-Ce6在激光照射下對共培養(yǎng)4T1-Luc/巨噬細(xì)胞的體外光療作用。數(shù)據(jù)表明，DS-Ce6處理后共培養(yǎng)細(xì)胞中4T1細(xì)胞的BLI明顯降低，且呈劑量和激光照射時(shí)間依賴性。此外，在DS-Ce6處理的4T1/巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)中，即使激光照射時(shí)間較短，4T1細(xì)胞的BLIs也明顯低于Ce6處理組。而后作者評估了Caspase-3和下游PARP的水平，因?yàn)镃aspase-3可被來自內(nèi)在和外在途徑的刺激激活造成凋亡，Western blot分析進(jìn)一步證實(shí)了DS-Ce6光激活后4T1-Luc/巨噬細(xì)胞凋亡且定量數(shù)據(jù)顯示，與Ce6處理的共培養(yǎng)細(xì)胞相比，激光照射下，DS-Ce6處理的共培養(yǎng)細(xì)胞中Caspase-3和PARP的表達(dá)水平增加。CLSM圖像證實(shí)，在共培養(yǎng)細(xì)胞中，DS-Ce6比Ce6能特異性靶向且更內(nèi)化DS-Ce6進(jìn)入M2樣巨噬細(xì)胞。將DS-Ce6內(nèi)化到M2樣巨噬細(xì)胞中，在激光照射下產(chǎn)生細(xì)胞毒性1O2，產(chǎn)生的1O2有效誘導(dǎo)M2樣巨噬細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致共培養(yǎng)組4T1細(xì)胞BLI降低。這些結(jié)果表明，DS-Ce6也能有效誘導(dǎo)4T1/巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞凋亡。

PDT藥物通常對細(xì)胞單層表現(xiàn)出體外光療作用。然而，單層細(xì)胞培養(yǎng)模型在復(fù)制和模擬實(shí)體腫瘤的缺氧條件、病理生理和多細(xì)胞耐藥方面存在局限性。因此，作者使用4T1/巨噬細(xì)胞的3D球體進(jìn)一步評估DS-Ce6的光療潛力。從結(jié)果可以看出，未經(jīng)激光照射的Ce6或DS-Ce6處理后的三維球體保持了三維球體的形態(tài)。然而，在激光照射下，DS-Ce6治療組三維球體的形態(tài)學(xué)變化比Ce6組更顯著，證實(shí)了DS-Ce6對三維球體的光療效果要強(qiáng)得多。

作者采用全身熒光法檢測Ce6和DS-Ce6在體內(nèi)的生物分布。結(jié)果表明在注射后最初1-2小時(shí)，Ce6處理小鼠全身可見較強(qiáng)的熒光強(qiáng)度，此后熒光強(qiáng)度迅速下降。注射后12小時(shí)，在游離Ce6處理小鼠中觀察到微弱的熒光信號，這意味著大部分Ce6從體內(nèi)清除。相比之下，在注射后最初1-3小時(shí)，DS-Ce6處理小鼠的熒光信號相對較低，此后熒光信號逐漸減弱，但在24小時(shí)內(nèi)全身仍可見。由于DS-Ce6與Ce6相比血液循環(huán)更長，因此在注射后12小時(shí)，DS-Ce6在腫瘤組織中的積累量相對高于游離Ce6。通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果作者證實(shí)了M2巨噬細(xì)胞在腫瘤組織內(nèi)的分布，證明了DS-Ce6對M2巨噬細(xì)胞的靶向能力。

熒光結(jié)果顯示，DS-Ce6處理組的熒光信號強(qiáng)于游離Ce6處理組，表明DS-Ce6對M2巨噬細(xì)胞的靶向能力高于游離Ce6，這是由于DS-Ce6與M2樣TAM上過表達(dá)的SR-A特異性結(jié)合。同時(shí)，觀察到大量F4/80(綠色)和CD206(藍(lán)色)雙陽性巨噬細(xì)胞，F(xiàn)4/80和CD206在4T1腫瘤組織內(nèi)共定位良好，表明M2巨噬細(xì)胞在腫瘤組織中浸潤分布豐富。更重要的是，F(xiàn)4/80和CD206陽性的M2巨噬細(xì)胞與DS-Ce6的熒光信號匹配良好，表明DS-Ce6可以特異性靶向腫瘤組織內(nèi)的M2樣TAM。