細(xì)胞凋亡檢測(cè)

一、細(xì)胞凋亡檢測(cè)介紹

人體內(nèi)的細(xì)胞注定是要死亡的，有些死亡是生理性的，有些死亡則是病理性的，有關(guān)細(xì)胞死亡過(guò)程的研究，已成為生物學(xué)、醫(yī)學(xué)研究的一個(gè)熱點(diǎn)。已知的細(xì)胞死亡方式起碼有兩種，即細(xì)胞壞死與細(xì)胞凋亡(apoptosis)。細(xì)胞壞死是早已被認(rèn)識(shí)到的一種細(xì)胞死亡方式，而細(xì)胞凋亡則是逐漸被認(rèn)識(shí)的一種細(xì)胞死亡方式。

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細(xì)胞凋亡是細(xì)胞的一種基本生物學(xué)現(xiàn)象，在多細(xì)胞生物去除不需要的或異常的細(xì)胞中起著必要的作用。它在生物體的進(jìn)化、內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定以及多個(gè)系統(tǒng)的發(fā)育中起著重要的作用。細(xì)胞凋亡不僅是一種特殊的細(xì)胞死亡類(lèi)型，而且具有重要的生物學(xué)意義及復(fù)雜的分子生物學(xué)機(jī)制。凋亡是多基因嚴(yán)格控制的過(guò)程，這些基因在種屬之間非常保守，如Bcl-2家族、caspase家族、癌基因如C-myc、抑癌基因P53等。而凋亡過(guò)程的紊亂可能與許多疾病的發(fā)生有直接或間接的關(guān)系。如腫瘤、自身免疫性疾病等，能夠誘發(fā)細(xì)胞凋亡的因素很多，如射線、藥物等。

二、檢測(cè)方法

細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，不同區(qū)域內(nèi)（如細(xì)胞膜、細(xì)胞漿、線粒體、細(xì)胞核等）會(huì)發(fā)生不同的生理生化改變。因此，針對(duì)不同區(qū)域的細(xì)胞凋亡檢測(cè)要采用不同的方法。

1）Annexin V 凋亡檢測(cè)

原理：Annexin Ⅴ是一種分子量為35-36kD的Ca依賴(lài)性磷脂結(jié)合蛋白，正常細(xì)胞中，磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine, PS）只分布在細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè)，細(xì)胞發(fā)生凋亡早期，膜磷脂酰絲氨酸（PS）由脂膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)。Annexin V作為一種磷脂結(jié)合蛋白，與PS有高度親和力，它通過(guò)細(xì)胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細(xì)胞的胞膜結(jié)合。因此Annexin V是檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡的靈敏指標(biāo)。該方法通常結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)一起使用。

2）線粒體膜電位分析（JC-1）

JC-1是一種廣泛用于檢測(cè)線粒體膜電位的理想熒光探針。可以檢測(cè)細(xì)胞、組織或純化的線粒體膜電位，線粒體膜電位的下降是細(xì)胞凋亡早期的一個(gè)標(biāo)志性事件。

原理：在線粒體膜電位較高時(shí)，JC-1聚集在線粒體的基質(zhì)（matrix）中，形成聚合物（J-aggregates），可以產(chǎn)生紅色熒光（Ex/Em = 585/590）；在線粒體膜電位較低時(shí)，JC-1不能聚集在線粒體的基質(zhì)中，此時(shí)JC-1為單體（monomer），可以產(chǎn)生綠色熒光（Ex/Em = 510/527 nm）。這樣就可以非常方便地通過(guò)熒光顏色的轉(zhuǎn)變來(lái)檢測(cè)線粒體膜電位的變化。

3）Caspase活性檢測(cè)

Caspase半胱氨酸蛋白酶家族引發(fā)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)是細(xì)胞凋亡過(guò)程的中心環(huán)節(jié)，其激活主要包括線粒體依賴(lài)途徑和死亡受體介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。

原理：激活后的下游 Caspase，通過(guò)切割特異性底物，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。Caspase的活化是導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的中心環(huán)節(jié)，細(xì)胞凋亡功能的抑制將導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生及免疫功能的異常，而細(xì)胞凋亡功能亢進(jìn)與組織損傷和器官功能衰竭的發(fā)病密切相關(guān)。

4）TUNEL凋亡檢測(cè)

細(xì)胞凋亡中, 染色體DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產(chǎn)生大量的粘性3'-OH末端，可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶(TdT)的作用下，將脫氧尿苷三磷酸核苷酸(dUTP)和熒光素形成的衍生物標(biāo)記到DNA的3'-末端，從而可進(jìn)行凋亡細(xì)胞的檢測(cè)，稱(chēng)為T(mén)UNEL法。由于正常的或正在增殖的細(xì)胞幾乎沒(méi)有DNA的斷裂，因而沒(méi)有3'-OH形成，很少能夠被染色。由此，TUNEL是檢測(cè)DNA 片段化（細(xì)胞凋亡）的常用方法。

細(xì)胞凋亡是生命的基本現(xiàn)象，是維持體內(nèi)細(xì)胞數(shù)量動(dòng)態(tài)平衡的基本措施。在胚胎發(fā)育階段通過(guò)細(xì)胞凋亡清除多余的和已完成使命的細(xì)胞，保證了胚胎的正常發(fā)育；在成年階段通過(guò)細(xì)胞凋亡清除衰老和病變的細(xì)胞，保證了機(jī)體的健康。和細(xì)胞增殖一樣細(xì)胞凋亡也是受基因調(diào)控的精確過(guò)程。

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